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凋亡檢測試劑盒說明書
發布時間:2020-11-20 點擊量:1113

 

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 凋亡檢測試劑盒說明書

 

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit 

 

目錄號:K2576     

保存:2-8  ℃避光保存 

 

組分說明

 

Cat.No.                      K2576

KitSize                        50

4×BindingBuffer                10ml

PropidiumIodide,PI             500 μl

AnnexinV-AlexaFluor488         250 μl

 

產品簡介 

 

   AnnexinV-AlexaFluor488/PI 凋亡檢測試劑盒是一種采用                AnnexinV-AlexaFluor488 與PI 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。

   細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使 PS 暴露在細胞膜外。AnnexinV 具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性,對 PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)不能通過完整的活細胞,但能夠對壞死和凋亡晚期的細胞進行染色,因此通常將AnnexinV 與  PI 配合染色,以區別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。

 

注意事項 

 

1.  消化細胞時不能用含EDTA 的胰酶。 

2.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。

3.  需自備PBS 和去離子水。

4.  熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

5.  PI 對人體有刺激性,請注意適當防護。

6.  請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 

操作步驟 

 

1. 細胞樣品的準備:

 

    a. 對于貼壁細胞:小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50μl 左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。再次加入1ml4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。

    b. 對于懸浮細胞:1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約                            50 微升左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,并轉移到1.5 毫升離心管內。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清,可以殘留約                                50μl 左右的   PBS,以避免吸走細胞。再次加入1ml4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。

2. 用去離子水按 1:4 稀釋BindingBuffer(4mlBindingBuffer+12ml 去離子水);

3. 用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞,調節其濃度為 1×106/ml;

4. 取100μl 的細胞懸液于 5ml 流式管中,加入5μlAnnexinV-AlexaFluor488 和             10 μl20μg/ml 的 PI 溶液;

5. 混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘;

6. 在反應管中加 400μlPBS,流式細胞儀(FACS)分析。



 



 

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