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酶聯斑點(Elispot)實驗服務

酶聯斑點(Elispot)實驗服務

產品型號:

所屬分類:免疫學實驗

產品時間:2022-05-18

簡要描述:酶聯斑點(Elispot)實驗服務
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詳細說明:

酶聯斑點(Elispot)實驗服務

 

 

酶聯斑點(Elispot) 技術概述:

  酶聯斑點(Elispot) 全名為酶聯免疫斑點檢測,英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結合了細胞培養技術與酶聯免疫吸附技術(即ELISA技術), 能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其技術原理,一句話概括就是:用抗體捕獲培養中的細胞分泌的細胞因子,并以酶聯斑點顯色的方式將其表現出來。

 

 

1、實驗的準備工作

(1)設備與耗材:

①超凈工作臺;

②5% CO2 37°C細胞培養箱;

③P20,P200, P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器,P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20,P200, P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

 

(2)溶液配制

①PBS:用分析純試劑,Millipore級別的純水配制, 高壓滅菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作。儲存于20-25°C, 可存放一個月。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL,加入Millipore級別的純水至100mL。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時,用PBS稀釋50倍,每孔50uL。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲液(Blocking stock solution R)稀釋10倍,每孔200uL。

⑦抗體稀釋液:注意,只是用來稀釋檢測抗體和酶聯親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書, 加入雙蒸水溶解。使用時,用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

⑨酶聯親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書,加入雙蒸水溶解。使用時,用抗體稀釋液稀釋100倍,每孔100uL。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書, 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝,-200C保存。

使用時,解凍,每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲存液(2mg/ml,Murex)分裝成20μL/EP管, -20*C長期凍存。 使用時,加入980μLU-Cytech無血清培養基(或者1640基本培養基),成為工作液(40μg/mL,10倍終濃度),每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。

②U-Cytech無血清培養基:我們推薦無血清ELISPOT技術,它能排除血清的干擾,結果更加穩定可靠,背景也更好。如果沒有,可以用含10%血清的1640培養基代替。

2、ELISPOT標準操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設計好試驗,把每個孔要加入的內容做成卡片,到時候就會從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預濕30秒。

注意:

①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的,經過乙醇潤濕之后,顏色變暗,變成半透明狀,很容易觀察二者的區別。

②加乙醇的時候,槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不到刺到PVDF膜。

③有時候,加入的乙醇掛在孔壁上, 這時要蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜,就會在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發生變化。

④15μL 是經過優化的體積,它能保證剛好完全浸潤整塊膜,而不會有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面,加深實驗的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次,盡量減少乙醇的殘留。

⑥按照試劑盒的使用說明,將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中,每孔加入50μL,4°C包被過夜。

⑦(次日)傾倒包被液,用PBS洗滌5次,后一次,在滅菌的吸水紙上扣干。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液,37°C封閉1小時。

⑨傾倒封閉液,無須洗滌,直接可以進行細胞培養。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存數周。)

 

(2)第二天:鋪細胞,加入刺激物,培養

①整個實驗設置-組正對照(PHA刺激), 每一個細胞樣品(同-個捐獻者或者實驗動物)要設一個負對照

(不加刺激物),整塊板還要加一個背景負對照(不含細胞,只加培養基和所有的檢測試劑)。

②填好實驗卡片,用以指導實驗的安排和細胞及試劑的添加。每一個細胞/刺激物的組合設置2-4個孔的重復(想要有統計學的意義,每個細胞/刺激物設4個孔的重復)。

④取出封閉好的板,準備加入細胞。如果是以前做的封閉,可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養基,室溫靜置10分鐘,傾倒,然后再重復- -次。

⑤按照實驗卡片的安排,加入不同濃度的細胞,100uLwell, 細胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細胞之后,不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓細胞更分散,實際情況剛好相反)。正對照的細胞濃度為1x105/well,實驗組的樣品細胞濃度請自行調整。

⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養基到背景負對照孔。

⑦正對照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入實驗者自己的刺激物(配制成10X終濃度,10uLwell)到實驗孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻,實際上,通過擴散,刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細胞成圈的分布在孔的外周。

⑨當加完所有的樣品之后,蓋上板蓋,放入二氧化碳培養箱,37°C培養18-24小時。 注意在整個培養過

程中避免移動、碰撞培養板。為了取得更好的結果,甚至開關培養箱的箱[ ]也應該禁止。因為碰撞會造成細胞的移位,造成斑點的模糊、拖尾。

 

(3)第三天:培養后操作

①傾倒孔內的細胞及培養基。

②低滲法將細胞裂解,每孔加入200μL冰冷的去離子水,將板置于冰上冰浴10分鐘。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍,洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋檢測抗體,每孔加入100μL生物素標記的檢測抗體,37°C 1小時。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍,洗滌后一遍時, 將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下,同時洗滌膜的正反兩面,蓋上保護層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

 

注意:

①洗滌膜的背面,我們摸索出的辦法是,在-個淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入,輕輕搖晃幾次即可。注意,-定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后,再合攏,蓋上,不要傷害到膜。

②按照試劑盒說明的濃度,用抗體稀釋液稀釋酶標的鏈霉親和素,每孔加入100L, 37°C 1小時。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍, 洗滌后-遍時,將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下,同時洗滌膜的正反兩面,蓋上保護層,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④照試劑盒的說明,解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液,室溫靜置20-30分鐘,注意避光。

⑤待斑點生長到適合的大小之后,以去離子水洗滌2遍,終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細小的水珠,之后取下保護層,放在通風的地方,室溫靜置10-30分鐘,讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內,防止膜發脆、破裂。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內,調節好合適的參數,半點計數,并記錄斑點的各種參數,作統計分析。

 

 

實驗代做服務:

ELISA試劑盒免費代檢測

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蛋白相互作用分析

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熒光定量PCR

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激光共聚焦

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染色質免疫沉淀CHIP

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